微小 ＲＮＡｓ （ｍｉＲＮＡｓ）是一 類 由 １８～２５ｎｔ
組成的非編碼 ＲＮＡ，可通過直接與靶基因的３′端
非翻譯區 （３′－ＵＴＲ）相互作用調控靶基因的表達，
參與細胞的增殖、分化和凋亡等生物過程，與包括
食管癌在內的多種疾病的發生發展有密切關聯。
ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ被證實在食管癌組織中表達下調，不
僅可通過靶 向 ＥＲＢＢ４、Ｉｒｆ２和 ＣＸＣＲ 參與 調 控 食
管癌的炎癥反應，還可通過靶向 ＥＲＢＢ４誘導癌細
胞凋亡和抑制細胞增殖；然而其 調 控 食 管 癌 細
胞增殖和凋亡的分子機制尚未見報道。上皮細胞轉
化序 列 ２ （ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ
２，ＥＣＴ２）基因被證實是一種重要的致癌基因，在
乳腺癌和肺腺癌等細胞增殖和凋亡過程中發揮重要作用。
１ 材料與方法
１．１ 細胞、主 要 試 劑 和 儀 器
人 食 管 癌 ＥＣ－１０９
細 胞和人正常食管上皮 ＨＥＴ－１Ａ 細 胞 （美 國
ＡＴＣＣ公司）。胎牛血清 （蘭州民海生物工程有限
公司），ＲＰＭＩ－１６４０ 培 養 基 （美 國 Ｇｉｂｃｏ 公 司），
胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亞 楓、 噻 唑 藍
（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，
ＭＴＴ） 試 劑 （美 國 Ｓｉｇｍａ 公 司 ），ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ
ｍｉｍｉｃｓ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及其 陰 性 對 照 片 段 （江 蘇 百 奧 邁
科 生 物 技 術 公 司）， 青 鏈 霉 雙 抗 混 合 液 （美 國
Ｇｅｍｉｎｉ公司），細 胞 周 期 蛋 白 Ｄ１ （ＣｙｃｌｉｎＤ１）抗
體、細 胞 周 期 蛋 白 依 賴 性 激 酶 ２ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１，ＣＤＫ２） 抗 體、ＥＣＴ２
抗 體、Ｂｃｌ－２ 相 關 Ｘ 蛋 白 （Ｂｃｌ－２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ
ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂａｘ）抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨
酸 蛋 白 水 解 酶 ３ （Ｃｌｅａｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３，Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３） 抗 體、
β肌動 蛋 白 （β－ａｃｔｉｎ） 抗 體 （武 漢 博 士 德 生 物 公司 ）， 硝 酸 纖 維 素 膜 （ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＣ）（美國 Ｐｉｅｒｃｅ公司），辣根過氧化
酶標記的二抗 （北京中杉金橋生物有限公司），報
告基因表達 載 體 （美 國 Ａｍｂｉｏｎ公司），二喹 啉 甲
酸 （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）蛋白 濃 度 測 定 試 劑
盒、電 化 學 發 生 （ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，
ＥＣＬ）試 劑 盒 （上 海 碧 云 天 生 物 技 術 研 究 所 ），
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ
２０００、實時熒光定量 ＰＣＲ試劑盒、
ｃＤＮＡ 合 成 試 劑 盒 （美 國 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ），
ＴＲＩｚｏｌ總 ＲＮＡ 抽提 試 劑 盒 （北京百泰克生物公
司），雙熒 光 素 酶 檢 測 試 劑 盒 （美 國 Ｐｒｏｍｅｇａ公
司），細胞凋亡檢測試劑盒 （美國 ＢＤ 公司）。流式
細胞儀 （美 國 ＢＤ 公司），ＰＣＲ 擴增 儀 （美 國 ＭＪ
公司），ＵＶＰ 凝膠圖象分析儀 （英國 ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ
公司），ＣＯ２ 細胞培養箱 （上海博迅醫療儀器有限
公司）。
１．２ 細胞培養
采用含有１０％胎牛血清和雙抗的
ＲＰＭＩ－１６４０培養基于體積分數為５％ＣＯ２、溫度為
３７℃、飽 和 濕度細胞培養箱中培養 ＥＣ－１０９ 和
ＨＥＴ－１Ａ 細胞。每隔２ｄ更換新鮮培養液。待細胞
鋪滿瓶底 時，以０．２５％胰蛋 白 酶 消 化 傳 代。收 集
生長良好的對數生長期細胞進行實驗。
１．３ 細胞 分 組 和 轉 染
將 ＥＣ－１０９細胞 分 為 空 白
對照組 （未轉染）、ｍｉＲ－ＮＣ組 （轉染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ
ｍｉｍｉｃｓ陰 性 對 照）、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 組 （轉 染 ｍｉＲ－
３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ）、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組 （轉 染 ｍｉＲ－
３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ陰 性 對 照） 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ
組 （轉染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），每組 設 ３ 個 復
孔。將 ＥＣ－１０９細胞以每孔５００μＬ （約３×１０６ 個）
接種至６孔細胞板上，培養箱內培養過夜。待細胞
貼壁生長 約 為７５％融合 時，參 照 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ
２０００說明書步驟將配制的脂質體 ｍｉＲＮＡ 混合物按
照實驗分組加入到 ＥＣ－１０９細胞中。轉染６ｈ后更
換含胎牛 血 清 的 新 鮮 培 養 基。繼 續 培 養 ４８ｈ 后，
收集各組細胞進行后續實驗。
１．４ 實時熒光定量
ＰＣＲ 法檢測 ＨＥＴ－１Ａ 細胞和
ＥＣ－１０９細胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達 水 平 收 集 未 轉
染的 ＨＥＴ－１Ａ 細胞、ＥＣ－１０９細胞和轉染４８ｈ的各
組 ＥＣ－１０９細胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ法提 取 總 ＲＮＡ，采
用分 光 光 度 計 測 定 ＲＮＡ 的濃度和完整性。參照
ｃＤＮＡ 合成試劑 盒 說 明 書 步 驟 反 轉 錄 合 成ｃＤＮＡ。
以ｃＤＮＡ 為模板進行 ＰＣＲ擴增。２０μＬ反應體系：
２μＬｃＤＮＡ， 加 入 １０μＬ２× 定 量 ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ、各 ０．０８ μＬ 上 下 游 引 物 （摩 爾 濃 度 為２０μｍｏｌ·Ｌ－１）、０．４ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶
（２．５Ｕ·μＬ－１）和 ６μＬｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ 反 應 體 系：
９５ ℃ 預 變 性 ３ ｍｉｎ，９５ ℃ 變 性３０ｓ、６０ ℃ 復 性
３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０個循環。ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ
引物：Ｆ５′－ＡＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧ－３′，Ｒ５′－
ＴＧＣＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ－３′； Ｕ６ 引 物：
Ｆ５′－ＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴ－３′，
Ｒ５′－ＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧ－３′。 以 Ｕ６
為內參，采 用 ２－△△Ｃｔ法 計 算 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 的 相 對
表達水平。實驗重復３次。
１．５ ＭＴＴ 法 檢 測 各 組 ＥＣ－１０９ 細 胞 活 性 以
１０００ｒ·ｍｉｎ－１離心 ５ ｍｉｎ 后收 集 各 組 ＥＣ－１０９ 細
胞，調整細胞濃度為２×１０４ ｍＬ－１。以每孔１００μＬ
平鋪于９６孔細胞板上，每組設３個平行孔。置于
細胞 培 養 箱 內 常 規 培 養，分 別 在 培 養 ２４、４８ 和
７２ｈ后向每孔中加入１０μＬ ＭＴＴ （５ｇ·Ｌ－１）溶
液孵育４ｈ，并以１００μＬ二甲基亞砜溶解 ＭＴＴ 結
晶。采用酶標儀在４５０ｎｍ 波長處檢測各組細胞的
吸光度 （Ａ）值，重復測量３次，取 Ａ 值平均值表
示各組細胞活性。
２ 結 果
食管癌 ＥＣ－１０９細胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平
（１．００±０．０６）明顯低于正常食管癌上皮 ＨＥＴ－１Ａ
細胞 （０．２６±０．２８） （ｔ＝４．４７６，Ｐ＝０．０１１）。與
空白 對 照 組 比 較，ｍｉＲ－ＮＣ 組 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組
ＥＣ－１０９細胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平差異無統
計學意義 （Ｐ＞０．０５）；ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細
胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達水平較 ｍｉＲ－ＮＣ組明顯升
高 （Ｐ＜０．０５），ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細胞
中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達水平較ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ組明顯降
低 （Ｐ＜０．０５）。見
３ 討 論
腫瘤發生發展過程中往往伴隨著某些 ｍｉＲＮＡｓ
的異 常 表 達，而 這 些 ｍｉＲＮＡｓ在 腫 瘤 細 胞 增 殖、
侵襲、轉移和凋亡過程中發揮重要作用；其中，
作為 ｍｉＲ－３０２ 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表，ｍｉＲ－
３０２ｂ在多種腫瘤的進程中扮演著重要角色。ｍｉＲ－
３０２ｂ－３ｐ在胃癌組織和細胞中表達水平下調，上調
其 表 達 可 通 過 靶 向 胰 島 素 樣 生 長 因 子 １ 受 體
（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＧＦ－１Ｒ）抑制 ＡＫＴ 信 號 通 路 的 激 活，影響周期相關蛋白
ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６ 和 凋 亡 蛋 白
Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２的表 達 發 揮 抑 制 細 胞 增 殖、細 胞 周 期
Ｇ１→Ｓ轉化并誘導細胞凋亡的作用。同時，ｍｉＲ－
３０２ｂ 還 可 通 過 靶 向 調 控 ＥｐｈＡ２ 減 弱 Ｗｎｔ／
β－ｃａｔｅｎｉｎ／ＥＭＴ 信號 級 聯 通 路 抑 制 胃 癌 細 胞 的 增
殖、侵 襲 和 遷 移。在 惡 性 胸 膜 間 皮 瘤 細 胞 中，
ｍｉＲ－３０２ｂ通過靶向 Ｍｃｌ－１抑制腫瘤細胞的增殖并
誘導細 胞 凋 亡。肝 癌 組 織 中 ｍｉＲ－３０２ｂ 表 達 降
低，ｍｉＲ－３０２ｂ過表 達 可 通 過 直 接 靶 向 Ａｋｔ２ 減弱
ＮＦ－κＢ和 ＭＭＰ－２ 的 表 達 抑 制 癌 細 胞 的 侵 襲 和 轉
移。此外，ｍｉＲ－３０２ｂ還可 通 過 靶 向 調 控 Ｅ２Ｆ１
增強乳腺癌細胞對順鉑的敏感性，降 低 細 胞 活
性?？梢?，ｍｉＲ－３０２ｂ可通過調控多種靶基因或
途徑調控腫瘤的發生發展。
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